28°C ջերմաստիճանում 25 օր ստատիկ ինկուբացիայից հետո *Pleurotus ostreatus* NRC620-ից ստացված լակկասը սնկային կուլտուրայի միջավայրում ցուցաբերել է ամենաբարձր ակտիվությունը: Այս ֆերմենտի համար օպտիմալ pH և ջերմաստիճանային արժեքները համապատասխանաբար կազմել են 3.0 և 70°C: 40°C և 50°C ջերմաստիճաններում 2 ժամ ինկուբացիայից հետո ֆերմենտի ակտիվությունը պահպանվել է համապատասխանաբար 68.33% և 59.61%: Ցիտրատ-ֆոսֆատային բուֆերում (pH 7.0) 2 ժամ ինկուբացիայից հետո ֆերմենտի ակտիվությունը մնացել է 100%: 10 մՄ MgSO₄ և CuSO₄-ի ավելացումը համապատասխանաբար մեծացրել է ֆերմենտի ակտիվությունը մոտավորապես 21%-ով և 35%-ով, մինչդեռ NaCl-ը, MnCl₂-ը, KCl-ը և CaCl₂-ը զսպել են ֆերմենտի ակտիվությունը: ABTS-ը որպես սուբստրատ օգտագործելով՝ *Pleurotus ostreatus* NRC 620 լակկազի կինետիկ պարամետրերը (Km և Vmax) համապատասխանաբար կազմել են 1.99 մՄ և 16,217 մկմոլ րոպե−1 լ−1: Խնձորի հյութի նմուշների ֆերմենտային մշակումը զգալիորեն նվազեցրել է ինչպես pH-ը, այնպես էլ մածուցիկությունը, և այս նվազումը կապված է պահպանման ժամանակի ավելացման հետ: Լակկազի մշակումը հանգեցրել է խնձորի հյութի ընդհանուր ֆենոլային պարունակության աննշան նվազման, սակայն հակաօքսիդանտային ակտիվության նվազում չի նկատվել:
Վերջին տարիներին հետազոտողները կենտրոնացել են կանաչ կենսատեխնոլոգիայի կիրառման վրա սննդի արդյունաբերության մեջ: Լակկասը սննդի արդյունաբերության ամենաօգտակար ֆերմենտներից մեկն է, որը կիրառություն է գտնում այնպիսի ոլորտներում, ինչպիսիք են հյութերի մշակումը, թխումը, գինու կայունացումը և սննդամթերքի օրգանոլեպտիկ հատկությունների բարելավումը:1Շատ բարձրակարգ բույսեր և միկրոօրգանիզմներ արտազատում են լակկազա,2և այնպիսի սնկերը, ինչպիսիք են դեյտերոմիցետները, ասկոմիցետները և բազիդիոմիցետները, նույնպես կարող են արտադրել լակկազա։3Լակկասը (EC 1.10.3.2) կապույտ օքսիդազ է, որը մոլեկուլային թթվածինը վերականգնում է ջրի՝ օգտագործելով պղնձի երեք տարբեր ատոմներից բաղկացած համակարգ, այդպիսով օքսիդացնելով տարբեր ֆենոլային միացություններ և արոմատիկ ամիններ: Մրգային և բանջարեղենային հյութերի արտադրության ընթացքում ֆերմենտատիվ և ոչ ֆերմենտատիվ շագանակագույնացումը կարևորագույն խնդիրներ են:4Քանի որ այս նյութերը բացասաբար են անդրադառնում հյութի գույնի, համի և բույրի վրա, դրանք պետք է հեռացվեն։5
Բոլոր մրգերից խնձորը ամենաշատ սպառվողն է ամբողջ աշխարհում և Եվրոպական Միությունում։ 2019 թվականին խնձորի արտադրությունը աշխարհում զբաղեցրել է երրորդ տեղը՝ գերազանցելով 87 միլիոն տոննան։6Խնձորը պարունակում է բազմաթիվ ֆենոլային միացություններ, այդ թվում՝ ֆլավոնոիդներ և ֆենոլաթթուներ, ինչպիսիք են կոֆեինաթթուն և քլորոգենաթթուն։7Քանի որ խնձորի հյութը սովորաբար սպառվում է իր թափանցիկ տեսքով, ֆենոլային բաղադրիչների մոտավորապես 50%-ից 90%-ը կորչում է ֆիլտրման գործընթացի ընթացքում։8Այսօր սպառողները հակված են ընտրել նվազագույն մշակված արտադրանք, ինչպիսին է մշուշոտ խնձորի հյութը՝ բարձր պոլիֆենոլային պարունակությամբ: Սակայն, բարձր ֆենոլային պարունակության պատճառով, այս տեսակի խնձորի հյութը հատկապես ենթակա է գունաթափման և մգացման:9Խնձորի հյութի մգացումը նվազեցնելու կամ կանխելու համար օգտագործվում են տարբեր տեխնոլոգիաներ, այդ թվում՝ ջերմային մշակման մեթոդներ, ինչպիսին է պաստերիզացումը 60–90°C ջերմաստիճանում:10Այնուամենայնիվ, ըստ Sauceda-Gálvez-ի հետազոտության11, ջերմային մշակումը կարող է ոչնչացնել ցնդող քիմիական նյութերը և ազդել խնձորի հյութի օրգանոլեպտիկ հատկությունների վրա: Ջերմային մշակման մեթոդների այլընտրանքներից են գերկրիտիկական ածխաթթու գազը, ուլտրամանուշակագույն ճառագայթումը, ուլտրաձայնը, բարձր հիդրոստատիկ ճնշումը կամ բարձր ճնշման հոմոգենացումը:12Այս տեխնոլոգիաների արդյունավետությունը և համապատասխան մրգահյութերի ստացումը կախված են օգտագործվող պարամետրերից և արտադրանքի բնութագրերից: Դրանց լայն կիրառումը սահմանափակվում է բարձր արժեքով, որոշ սննդամթերքի որակի վրա բացասական ազդեցությամբ կամ ֆերմենտների անբավարար ինակտիվացմամբ:13,14
Լակկասը կարող է օգտագործվել մրգային հյութը կայունացնելու և պարզեցնելու համար։15Գյոքմեն և այլք։16Խորհուրդ է տրվում օգտագործել լակկասը մրգային հյութի մաքրման համար, քանի որ այն արդյունավետորեն հեռացնում է ֆենոլային միացությունները՝ դրանք վերածելով պոլիմերների կամ օլիգոմերների, որոնք հեշտությամբ հեռացվում են ցանկացած ուլտրաֆիլտրացիոն թաղանթով, ինչը թույլ է տալիս խնձորի հյութին պահպանել կայուն գույն և մաքրություն մինչև վեց շաբաթ 50°C ջերմաստիճանում: Մաքրված *Trichoderma* լակկասը անշարժացվել է ալյումինի գնդիկների վրա և օգտագործվել է խնձորի հյութի մանրէային աղտոտման հետևանքով առաջացած անհաճ համային միացությունները ընտրողաբար հեռացնելու համար:17
Խնձորի հյութի ցնդող բաղադրիչների մոտավորապես 80-90%-ը էսթերներ և ալդեհիդներ են, որոնք հյութին հաղորդում են յուրահատուկ բույր։18*Trametes versicolor*-ի լակկասը անշարժացվել է երիտասարդ կոկոսի կճեպների բնական մանրաթելից պատրաստված էժան հենարանի վրա՝ խնձորի հյութը մաքրելու համար։19Նախորդ ուսումնասիրություններում ուսումնասիրվել է խնձորի հյութի կայունացումը (գույնը և պղտորությունը)՝ օգտագործելով ֆերմենտներից զերծ կամ անշարժացման մեթոդներ, կամ ուլտրաֆիլտրացիայի հետ համակցված։5,19Սակայն, սնկային լակազների ազդեցությունը խնձորի հյութի ֆիզիկաքիմիական հատկությունների վրա պահպանման ընթացքում մնում է անհասկանալի։ Հետևաբար, այս ուսումնասիրության նպատակն էր փորձարարականորեն ուսումնասիրել խնձորի հյութի ֆիզիկաքիմիական հատկությունների, ֆենոլային միացությունների պարունակության և հակաօքսիդանտային ակտիվության փոփոխությունները սնկային լակազներով մշակումից և երկշաբաթյա սառնարանային պահպանումից հետո։ Լակազներն ունեն ֆենոլային միացությունները օքսիդացնելու ունակություն, ինչը դրանք խոստումնալից է դարձնում տարբեր արդյունաբերական գործընթացներում, այդ թվում՝ հյութի մաքրման համար։ Այս ուսումնասիրությունը ուսումնասիրել է *Pleurotus ostreatus* NRC 620 լակազները՝ կենտրոնանալով դրանց ակտիվության և հյութի մաքրման արդյունավետության իդեալական պայմանների վրա։ Չնայած խեցգետնի սնկերի (P. ostreatus NRC 620) վերաբերյալ հետազոտությունները դեռևս սահմանափակ են, նախորդ ուսումնասիրություններում ուսումնասիրվել են տարբեր սնկային աղբյուրներից ստացված ֆերմենտներ, ինչպիսիք են Trametes versicolor-ը և Ganoderma lucidum-ը։ Այս ուսումնասիրության նպատակն էր գնահատել այս ֆերմենտի հնարավոր կիրառումը սննդի արդյունաբերության մեջ և ընդգծել դրա եզակի հատկությունները, մասնավորապես՝ դրա իդեալական pH-ը և ջերմաստիճանը։
2,2′-Ազոօքսիբիս(3-էթիլբենզոթիազոլին-6-սուլֆոնաթթու) (ABTS)-ը գնվել է Sigma-Aldrich-ից (Կանադա): Մնացած բոլոր ռեակտիվները վերլուծական որակի էին:
Ազգային հետազոտական կենտրոնի մանրէային կուլտուրաների հավաքագրման կենտրոնը ձեռք է բերել NRC620 հայտնի խեցգետնասունկի շտամը: Ենթամշակույթից հետո այս շտամը պահվել է կարտոֆիլի դեքստրոզային ագարի թեք շերտերի վրա 4°C ջերմաստիճանում: Պատվաստանյութի պատրաստման եղանակը հետևյալն էր. 10-օրյա, լիովին զարգացած միցելիումը պատվաստվել է կարտոֆիլի դեքստրոզային ագարի թիթեղների վրա և ինկուբացվել 28°C ջերմաստիճանում: 10 օր անց ագարի միջավայրից ստերիլ մետաղական դակիչի միջոցով հանվել են երեք 12 մմ տրամագծով միցելիալ բլոկներ և տեղադրվել 250 մլ Էրլենմայերի սրվակների մեջ՝ բամբակյա խցաններով, որոնք պարունակում էին 50 մլ ստերիլիզացված կուլտուրայի միջավայր (pH 5.0, ինչպես նախկինում նկարագրվել է Օթմանի և այլոց կողմից):20)։ Մշակույթները ինկուբացվել են 28°C ջերմաստիճանում 18 օր։ Այնուհետև մշակույթները զտվել են Whatman No. 1 ֆիլտրի թղթի միջով, և ստացված վերին շերտը ծառայել է որպես ֆերմենտի աղբյուր։
Լակկազի ակտիվությունը որոշվել է ABTS-ը որպես սուբստրատ օգտագործելով: Ռեակցիայի խառնուրդը (2 մլ) պարունակում էր 500 մկլ 0.3 մՄ ABTS (լուծված 0.1 Մ նատրիումի ցիտրատային բուֆերում, pH 4.5) և անհրաժեշտ քանակությամբ ֆերմենտային նմուշ, որը նոսրացված էր թորած ջրով:21,22Հաշվի առնելով, որ լակկասը կարող է օքսիդացնել ABTS-ը սենյակային ջերմաստիճանում (28 °C ± 2), ABTS-ի օքսիդացումը որոշվել է 420 նմ-ում կլանման աճը չափելով (ε420= 36,000 սմ-1 M -1)՝ օգտագործելով Agilent Carry-100 ուլտրամանուշակագույն սպեկտրոֆոտոմետր: 1 մկմոլ ABTS-ը րոպեում օքսիդացնելու համար անհրաժեշտ էր լակկազի ակտիվության մեկ միավոր: Սպիտակուցի կոնցենտրացիան որոշվել է Բրեդֆորդի մեթոդով՝ որպես ներքին վերահսկողություն օգտագործելով խոշոր եղջերավոր անասունների շիճուկային ալբումինը:23,24
NRC 620 խեցգետնի սնկի շտամից ֆերմենտը ստանալուց հետո, դրա ակտիվությունը չափվել է տարբեր մշակության ինտերվալներում՝ 25 օրվա ընթացքում, ստատիկ պայմաններում՝ 28°C ջերմաստիճանում։
Լակկազի ակտիվության վրա ջերմաստիճանի ազդեցությունը ուսումնասիրելու համար փորձերը կատարվել են 20-ից 90°C ջերմաստիճանային միջակայքում: Ֆերմենտը ավելացնելուց և ռեակցիան սկսելուց առաջ բուֆերը (0.1 Մ նատրիումի ցիտրատ, pH 4.5) և սուբստրատը (ABTS) խառնվել և ինկուբացվել են 5 րոպե տարբեր ջերմաստիճաններում: Ֆերմենտի ջերմային կայունությունը գնահատվել է 0.05 Մ նատրիումի ֆոսֆատային բուֆերում (pH 7.0) ինկուբացմամբ համապատասխանաբար 40, 50, 60 և 70°C ջերմաստիճաններում՝ 2 ժամվա ընթացքում: Այնուհետև մնացորդային ակտիվությունը գնահատվել է ABTS սուբստրատի միջոցով:
pH-ի ազդեցությունը լակկազի ակտիվության վրա գնահատվել է ABTS-ի՝ որպես սուբստրատի միջոցով, 0.1 Մ ցիտրատ-ֆոսֆատային բուֆերներում՝ 2.5-ից 7.0 pH միջակայքում: Ֆերմենտային լուծույթը երկու ժամ ինկուբացվել է 40°C ջերմաստիճանում 0.1 Մ ցիտրատային և Tris բուֆերներում (pH 3, 4, 6 և 7)՝ pH-ի կայունությունը գնահատելու համար: ABTS-ի՝ որպես սուբստրատի դեպքում մնացորդային ակտիվությունը հաշվարկվել է ինկուբացիայից հետո:
Լակկասը 10 րոպե ինկուբացվել է նատրիումի ֆոսֆատային բուֆերում (0.05 Մ, pH 7.0), որը պարունակում էր տարբեր մետաղական իոններ (Mg2+, Cu2+, Co2+, Ca2+, Zn2+, K+, Na+ և Mn2+) համապատասխանաբար 2.5 մՄ և 10 մՄ կոնցենտրացիաներով: Այնուհետև ավելացվել է սուբստրատ (ABTS)՝ ռեակցիան սկսելու համար, և գնահատվել է հարաբերական ակտիվությունը:
Լակկազի կողմից ABTS-ի օքսիդացումը տարբեր կոնցենտրացիաներում (0.025–3 մՄ) չափվել է pH 4.5-ում՝ կինետիկ պարամետրերը (Vmax և Km) որոշելու համար։հաստատուններՄիքայելիս-Մենտենի հավասարման հաշվարկները կատարվել են Lineweaver-Burk գրաֆիկի միջոցով, որը ներկայացնում է ռեակցիայի արագության հակադարձը որպես սուբստրատի կոնցենտրացիայի ֆունկցիա: Կինետիկ հաստատունները հաշվարկվել են Lineweaver-Burk գրաֆիկից՝ օգտագործելով GraphPad Prism տարբերակ 6.01 ծրագիրը:
Խնձորները ծորակի ջրով մանրակրկիտ լվանալուց հետո, դրանք կիսով չափ կտրվեցին և հյութը քամեցին լիովին ավտոմատ Braun MP80 խնձորի հյութաքամիչով (արտադրված Գերմանիայում): Հյութը զտվեց չորս շերտով մանյակով: Վերահսկիչ խմբին ֆերմենտներ չավելացվեցին, մինչդեռ թարմ պատրաստված խնձորի հյութին ավելացվեց 2.0% լակկազա (փորձարկված ամենաարդյունավետ կոնցենտրացիան), որը այնուհետև պահվեց 4°C ջերմաստիճանում երկու շաբաթ:
Տիտրացվող թթվայնությունը (TA) և pH-ը որոշվել են Բուլտոնի ևալ.27Յուրաքանչյուր նմուշի pH-ը չափվել է թվային pH չափիչով (JENWAY 3510 pH չափիչ): Տիտրվող թթվայնությունը (TA) հաշվարկվել է խնձորաթթվի հիման վրա՝ օգտագործելով հետևյալ բանաձևը:
Որտեղ V-ն և C-ն համապատասխանաբար տիտրման մեջ օգտագործված նատրիումի հիդրօքսիդի լուծույթի ծավալն են (մլ) և կոնցենտրացիան (0.1 մոլ/լ): K-ն խնձորաթթվի փոխակերպման գործակիցն է, որը հավասար է 0.067-ի, իսկ W-ն՝ խնձորի հյութի զանգվածը (գ):
Լուծվող պինդ նյութերի ընդհանուր քանակը (Առևտրի ծառայությունների սակագինԲոլոր հյութի նմուշների պարունակությունը որոշվել է PAL-1 գրպանային ռեֆրակտոմետրի միջոցով (ATAGO, Տոկիո, Ճապոնիա): Յուրաքանչյուր չափումից հետո օպտիկական ոսպնյակը լվացվել է ապաիոնացված ջրով, և խնձորի հյութի յուրաքանչյուր նմուշ փորձարկվել է երեք անգամ: Յուրաքանչյուր նմուշի արժեքը հաշվարկվել է երեք չափումների միջինացման միջոցով: Խնձորի հյութի յուրաքանչյուր նմուշի միջին ± ստանդարտ շեղումը նույնպես հաշվարկվել է այս արդյունքների միջինացման միջոցով:
Խնձորի հյութի նմուշների մածուցիկության առաձգականությունը գնահատվել է պտտվող մածուցիկաչափի միջոցով (RV, Rheotest 2, Գերմանիա): Նմուշը տեղադրվել է մածուցիկաչափի «S2» գլանի ներսում: Տեսանելի մածուցիկությունը ներկայացվել է սղման լարման և սղման արագության կորի թեքությամբ, որը հաշվարկվել է սղման լարումից և համապատասխան կորերից՝ տարբեր սղման արագությունների դեպքում (1.00-ից մինչև 437.4 վ⁻¹): Տեսանելի մածուցիկությունը հաշվարկելու բանաձևը հետևյալն է.
Որտեղ η-ն ակնհայտ մածուցիկությունն է (cP), τ-ն՝ սղման լարումը (dyn/cm²), γ-ն՝ սղման արագությունը (sec⁻¹), իսկ (τ)-ն հաշվարկվում է պտտող մոմենտի (α) և գլանի (Z) արժեքների միջոցով՝ օգտագործելով հետևյալ բանաձևը՝ τ = Z . α:
Բրաունինգի ինդեքսը որոշվել է Մեյդավ և այլնի մեթոդով։ալ.2910 մլ հյութի նմուշը ցենտրիֆուգացվել է 2750 xg-ով 10 րոպե։ Հյութի վերին շերտի 5 մլ-ը խառնվել է 5 մլ 95% էթանոլի հետ։ Խառնուրդի կլանումը չափվել է 420 նմ-ում՝ օգտագործելով Shimadzu UV սպեկտրոֆոտոմետր (UV-1601 PC):
Ընդհանուր ֆենոլային պարունակությունը (ԸՖՊ) որոշվել է գունաչափական եղանակով՝ օգտագործելով Ֆոլին-Չիոկալտեուի ռեակտիվը, ինչպես նկարագրվել է Բուլտոնի և այլոց կողմից։[27]] Գալաթթվի ստանդարտ կորը կառուցվել է 0-ից մինչև 500 մգ/լ կոնցենտրացիաների համար (r²= 0.997): Արդյունքները արտահայտվում են գալաթթվի համարժեքներով (մգ GAE/մլ):
25 մկլ խնձորի հյութին ավելացրեք 125 մկլ թորած ջուր և 2850 մկլ FRAP լուծույթ և խառնուրդը թողեք մթության մեջ։30րոպե։ Այնուհետև չափեք աբսորբցիան 593 նմ-ում՝ օգտագործելով Shimadzu UV սպեկտրոֆոտոմետր (UV-1601 PC): FRAP ռեակտիվը պատրաստվել է՝ խառնելով 300 մՄ ացետատային բուֆեր (pH 3.6), 20 մՄ երկաթի (III) քլորիդ և 10 մՄ 2,4,6-տրիս(2-պիրիդիլ)տրիազին (TPTZ) (լուծված 40 մՄ HCl-ում) 10:1:1 հարաբերակցությամբ: Ստանդարտ կորը ստացվել է՝ օգտագործելով Trolox-ը որպես ստանդարտ (R²= 0.999), և արդյունքները արտահայտվում են որպես μM Տրոլոքս/մլ։
Մշակված և չմշակված հյութերի հակաօքսիդանտային ակտիվությունը որոշվել է DPPH մեթոդով՝ DPPH ազատ ռադիկալները չեզոքացնելու դրանց ունակությունը գնահատելու համար։31Տասը միկրոլիտր հյութ խառնվեց 1 մլ DPPH լուծույթի (100 μM) հետ մեթանոլում: 30 րոպե մթության մեջ ռեակցիան անցկացնելուց հետո խառնուրդի կլանումը չափվեց 517 նմ-ում՝ օգտագործելով Shimadzu UV սպեկտրոֆոտոմետր (UV-1601 PC): Արդյունքները արտահայտվեցին որպես տրոլոքսի համարժեքներ (μM տրոլոքս/մլ)՝ հիմնվելով տրամաչափման կորի վրա (R2= 0.990):
Ստացված տվյալները ցույց տվեցին, որ NRC 620 խեցգետնի սնկերի մոտ լակկազի առավելագույն արտադրությունը դիտվել է խմորման 18-րդ օրվա վերջում՝ հասնելով 1302 U/L ակտիվության: Սա հիմք է հանդիսացել լակկազի արտադրության օպտիմալ մշակման ժամանակը որոշելու համար (Նկար 1): Չնայած ֆերմենտների արտադրությունը մեծացել է մշակման ժամանակի ավելացման հետ, աճի տեմպը ուղիղ համեմատական չէր մշակման ժամանակին. 21 օր անց ֆերմենտային ակտիվությունը աճել էր ընդամենը 90 U/L-ով (մինչև 1390 U/L): Հետևաբար, 18 օրը վերջնականապես ընտրվել է որպես մշակման օպտիմալ ժամանակ՝ արտադրանքի բերքատվությունը հավասարակշռելու մշակման ժամանակի ավելացման տնտեսական օգուտների հետ:
Pleurotus ostreatus NRC 620-ում մշակության ժամանակի ազդեցությունը լակկազի բերքատվության վրա: Երեք (12 մմ) սնկային միցելիալ բլոկներ ներարկվել են 50 մլ ստերիլ միջավայրի մեջ և այնուհետև մշակվել են 28°C ջերմաստիճանում տարբեր ժամանակներում:
Համապատասխանելով այլ ուսումնասիրություններին, մեր արդյունքները ցույց են տալիս, որ սնկերի կողմից լակկազի գագաթնակետային սեկրեցիայի հասնելու իդեալական կուլտուրայի ժամանակահատվածը, հավանաբար, 7-ից 36 օր է։32Ըստ Էզիկեի և այլոց33, *Trametes polyzona* WRF03-ը ֆերմենտացիայի իններորդ օրվա վերջում արտադրել է լակկազի ամենաբարձր քանակը՝ 1637 U/մգ սպիտակուցի տեսակարար ակտիվությամբ։ Ավելին, Օթմանը և այլք։34պարզվել է, որ *Trichoderma harzianum* S7113-ը մեծ քանակությամբ լակկազա է արտազատել կուլտուրայի հինգերորդ օրը: Լակկազի արտադրության արագությունը գագաթնակետին է հասել տասնչորսերորդ օրը, ապա աստիճանաբար նվազել է:34Չնայած ֆերմենտների սեկրեցիան կարող է տեղի ունենալ նաև հիմնական աճի փուլում, այն սովորաբար գագաթնակետին է հասնում միջանկյալ փուլում և ակտիվանում է ածխածնի կամ ազոտի աղբյուրի սպառմամբ։34,35
Չնայած Pleurotus ostreatus NRC 620-ի լակկասը ցուցաբերել է բարձր ակտիվություն 50°C-ից մինչև 80°C լայն ջերմաստիճանային միջակայքում՝ մոտենալով գագաթնակետային ակտիվությանը (69–98%), դրա առավելագույն ակտիվությունը դիտվել է 70°C-ում (Նկ. 2ա): Այս ջերմաստիճանային միջակայքից դուրս ֆերմենտային ակտիվությունը նվազել է մոտավորապես 70°C-ում: Այս արդյունքները ենթադրում են, որ ֆերմենտը ակտիվ է բարձր ջերմաստիճաններում, հավանաբար այն պատճառով, որ բարձր ջերմաստիճանը մեծացնում է ռեակցիայի կինետիկ էներգիան:
Ռեակցիայի ջերմաստիճանի (ա) և pH-ի (բ) ազդեցությունը լակկազի ակտիվության վրա *Pleurotus ostreatus* NRC 620-ում: 20-ից 90°C ջերմաստիճանները ստացվել են խառնուրդը տարբեր ջերմաստիճաններում 5 րոպե նախնական ինկուբացմամբ՝ ֆերմենտը ավելացնելուց և ռեակցիան սկսելուց առաջ: pH-ի ազդեցությունը լակկազի ակտիվության վրա գնահատվել է ABTS-ի միջոցով՝ որպես սուբստրատ՝ 0.1 Մ ցիտրատ-ֆոսֆատային բուֆեր պարունակող լուծույթներում՝ 2.5-ից 7.0 pH միջակայքում:
Ըստ Էզիկեի ևալ.33*Trametes polyzona* WRF03 լակկազի համար օպտիմալ ջերմաստիճանը 55°C է, որը նույնն է, ինչ *Ganoderma lucidum*-ի համար։լակասե36և նման է *Trametes polyzona* KU-RNW02737-ի համար օպտիմալ ջերմաստիճանին (50 °C):լակկազա . Բալդրիան38նշում է, որ ինչպես լիգնինը քայքայող այլ ֆերմենտային համակարգերի դեպքում, լակկազի համար իդեալական ջերմաստիճանային միջակայքը 50-ից 70°C է։
Արդյունքները ցույց տվեցին, որ ֆերմենտը ցուցաբերել է ամենաբարձր ակտիվությունը pH 3.0-ի դեպքում՝ հասնելով 94% ակտիվության pH 3.5-ի դեպքում: Այնուամենայնիվ, այն մնացել է ակտիվ pH-ի լայն միջակայքում՝ 2.5-ից մինչև 7.0 (Նկար 2բ): Ավելին, այն ցուցաբերել է ավելի բարձր ակտիվություն թթվային պայմաններում՝ համեմատած չեզոք կամ ալկալային պայմանների հետ: Դրա ակտիվությունը մնացել է առնվազն 77% pH 2.5-ից մինչև 4.5 միջակայքում, բայց pH 7.0-ի դեպքում հասել է միայն մոտավորապես 38%-ի: *Trametes polyzona* WRF03-ից ստացված լակկազի համար օպտիմալ pH-ը 4.533 էր, որը նույնն է, ինչ *Trametes polyzona* KU-RNW02737, *Trichoderma harzanium* 39, *Pleurotus* sp. 40 և *Trametes hirsuta* 41 լակկազի համար: Այնուամենայնիվ, Չայրինի և այլոց ուսումնասիրության համաձայն:42, *Polymorpha f. sp.* WR710-1-ից լակկազի օպտիմալ pH-ը 2.2 է, մինչդեռ *Polymorpha f. sp.* IBL-04-ից լակկազի օպտիմալ pH-ը 5.043 է: Հիդրօքսիդային անիոնների (լակկազի ինհիբիտոր) կապումը T2/T3 լակկազի պղնձի ատոմների հետ կարող է լինել լակկազի ակտիվության նվազման պատճառը չեզոք կամ ալկալային pH պայմաններում: Սա կարող է խաթարել ներքին էլեկտրոնների փոխանցումը T1 կենտրոնից դեպի T2/T3 կենտրոն, դրանով իսկսահմանափակողֆերմենտային ակտիվությունը23,44
Ֆերմենտը տարբեր ջերմաստիճաններում ինկուբացելով՝ պարզվեց, որ ինկուբացիայի ժամանակը և ջերմաստիճանը ազդում են ֆերմենտի կայունության վրա։ Նշենք, որ *Trametes polyzona* NRC 620-ից ստացված լակկասը ցուցաբերել է ավելի բարձր կայունություն 40℃ և 50℃ ջերմաստիճաններում՝ 120 րոպե անց պահպանելով իր սկզբնական ակտիվության համապատասխանաբար 68.33% և 59.61%-ը (Նկար 3ա): Ի տարբերություն դրա, նույն պայմաններում (40℃ և 50℃, 120 րոպե), *Trametes polyzona* WRF03-ից ստացված լակկասը պահպանել է իր ակտիվության համապատասխանաբար 64.38% և 42.92%-ը։33Ընդհակառակը, ինկուբացիայի ժամանակի և ջերմաստիճանի ավելացումը նվազեցրեց *Trametes polyzona* NRC 620 լակկազի կայունությունը։ 60℃ և 70℃ ջերմաստիճաններում 60 րոպե ինկուբացիայից հետո դրա ակտիվությունը նվազեց համապատասխանաբար մինչև 39.24% և 1.72% (Նկար 3ա): Փորձարարական արդյունքներին համապատասխան, *Trametes polyzona* WRF03-ից ստացված լակկասը ջերմային մշակման ողջ ընթացքում ցուցաբերեց ավելի բարձր կայունություն 40 և 50℃ ջերմաստիճաններում։33Նմանապես, Լուեանջարոենկիտը ևալ.37և Չայրին և այլնալ.42Հաղորդվել է Trametes polyzona KURNW027 և Trametes polyzona WR710-1 լակազների կայունության մասին համապատասխանաբար 50°C ջերմաստիճանում 1 ժամվա ընթացքում: Որպես օգտակար կենսակատալիզատոր, որը կիրառելի է տարբեր կենսատեխնոլոգիական ոլորտներում, լակազը պետք է ունենա լավ կայունություն և կատարողականություն լայն ջերմաստիճանային տիրույթում:
*Pleurotus ostreatus* NRC 620 լակկազի ջերմաստատիկ կայունությունը (ա) և pH կայունությունը (բ): Ջերմաստատիկ կայունությունը գնահատվել է՝ ֆերմենտի լուծույթը համապատասխանաբար 40, 50, 60 և 70°C ջերմաստիճաններում 2 ժամ ինկուբացելով 0.05 Մ նատրիումի ֆոսֆատային բուֆերում (pH 7.0): pH կայունությունը գնահատվել է՝ ֆերմենտի լուծույթը 40°C ջերմաստիճանում 2 ժամ ինկուբացելով 0.1 Մ ցիտրատային բուֆերում և Tris բուֆերում (pH 3, 4, 6 և 7): Մնացորդային ակտիվությունը հաշվարկվել է ինկուբացիայից հետո ABTS-ը որպես սուբստրատ օգտագործելով:
Ֆերմենտի օգտագործման և պահպանման օպտիմալ պայմանները որոշելու համար մենք ուսումնասիրել ենք pH-ի ազդեցությունը լակկազի կայունության վրա: Տարբեր pH արժեքների ազդեցությունը զգալիորեն ազդել է սպիտակուցային կառուցվածքի կայունության վրա, դրանով իսկ ազդելով ֆերմենտի մոլեկուլի կայունության և ակտիվության վրա: Արդյունքները ցույց են տվել, որ ֆերմենտն ավելի քիչ կայուն է եղել թթվային պայմաններում, մինչդեռ ավելի լավ կայունություն է ցուցաբերել ավելի բարձր pH արժեքների դեպքում (չեզոք և ալկալային շրջաններ): 7.0, 6.0, 4.0 և 3.0 pH արժեքների դեպքում ֆերմենտի պահպանման արագությունը 120 րոպեից հետո կազմել է համապատասխանաբար մոտավորապես 100%, 62.54%, 52.39% և 11.14% (Նկար 3բ): *Strombus multisus* WRF03 լակկասը ցույց է տվել ավելի բարձր կայունություն չեզոք pH արժեքների դեպքում (5.5–6.5) և ավելի ցածր կայունություն թթվային pH արժեքների դեպքում (4.0-ից ցածր): 5.5, 6.0 և 6.5 pH արժեքների դեպքում 120 րոպե անց ֆերմենտի պահպանման մակարդակները համապատասխանաբար կազմել են մոտավորապես 82%, 100% և 93%:33Խաիրին և այլք։42նշել են, որ Trametes polyzona WR710-1-ից ստացված լակկասը կայուն է եղել 6.0-ից մինչև 7.0 pH միջակայքում, մինչդեռ Սայեդը և այլք։45ցույց տվեց, որ լակկասը ավելի կայուն էր չեզոք pH պայմաններում: Այնուամենայնիվ, Cerrena unicolor-ից ստացված լակկասը կայունություն ցուցաբերեց նաև ալկալային պայմաններում (pH 9.0):46Ուսումնասիրված լակազները ցուցաբերել են բարձր կայունություն pH-ի լայն միջակայքում: Սա կարող է կարևոր բնութագիր լինել արդյունաբերական կիրառությունների համար:
Քանի որ որոշ մետաղական իոններ ունեն ինչպես խթանող, այնպես էլ արգելակող ազդեցություն ֆերմենտային ակտիվության վրա, արդյունաբերական կիրառություններում պետք է հաշվի առնել դրանց ազդեցությունը ֆերմենտային ակտիվության վրա: Սա կարևոր է, քանի որ մետաղական իոնները տարածված շրջակա միջավայրի աղտոտիչներ են, որոնք կարող են ազդել արտաբջջային ֆերմենտների կայունության և սինթեզի վրա:47*Pleurotus ostreatus* NRC 620-ից ստացված լակկազի վրա բազմաթիվ մետաղական իոնների ազդեցությունը հետազոտելու համար մենք անցկացրեցինք համապատասխան փորձեր: Ինչպես ցույց է տրված նկար 4-ում, կախված օգտագործվող մետաղի տեսակից, մետաղական իոնների կոնցենտրացիայի 2.5 մՄ-ից մինչև 10 մՄ բարձրացումը բացասաբար է ազդել ֆերմենտի ֆունկցիայի վրա: Օրինակ՝Մգ²⁺ , Co²⁺ , Zn²⁺, ևCu²⁺կարող է խթանել և ակտիվացնել ֆերմենտային ակտիվությունը, մինչդեռՆա⁺ , Mn²⁺ , Ca²⁺, ևԿ⁺կարող էր արգելակել ֆերմենտային ակտիվությունը: 10 մՄ կոնցենտրացիայի դեպքում Cu²⁺ և Mg²⁺ իոնները *Pleurotus ostreatus* NRC 620-ից լակկազի ակտիվության ամենաուժեղ ակտիվատորներն էին՝ ապահովելով համապատասխանաբար մոտավորապես 34% և 20% ակտիվացման աստիճան: Այնուամենայնիվ, 10 մՄ կոնցենտրացիայի դեպքում Ca²⁺ իոնները լակկազի ամենաուժեղ արգելակիչներն էին, որոնք նվազեցնում էին ֆերմենտային ակտիվությունը մոտավորապես 60%-ով:
Մետաղական իոնների ազդեցությունը Pleurotus ostreatus NRC 620 լակկազի ակտիվության վրա: Լակկազան 10 րոպե ինկուբացվել է նատրիումի ֆոսֆատային բուֆերում (0.05 Մ, pH 7.0), որը պարունակում էր տարբեր մետաղական իոններ 2.5 մՄ և 10 մՄ կոնցենտրացիաներով: Այնուհետև ռեակցիան սկսվել է սուբստրատի (ABTS) ավելացմամբ, որից հետո չափվել է հարաբերական ակտիվությունը:
Մեր արդյունքները համապատասխանում են այլ հեղինակների արդյունքներին, որոնք պարզել են, որ Mg²⁺-ը և Cu²⁺-ը ուժեղացնում են *Trametes polyzona* WRF03³-ի ակտիվությունը: Կաստանյոն և այլք⁴⁸ պարզել են, որ *Xylaria* sp.-ից ստացված լակկասը որոշ չափով խթանվում է պղնձի իոններով (Cu²⁺): Ավելին, Ֆորոուտանֆարը և այլք⁴⁹ և Սիը և այլք⁵⁰ նմանատիպ ուսումնասիրություններ են անցկացրել համապատասխանաբար *Paraconiothyrium variabile* և *Trametes pubescens* լակկասների վրա: Այս ֆերմենտի II տիպի պղնձի կապման տեղը (T2) կարող է հագեցած լինել Cu²⁺-ով տվյալ կոնցենտրացիայի դեպքում, ինչը կարող է բացատրել լակկազի ակտիվության խթանումը Cu²⁺⁹ ավելի բարձր կոնցենտրացիաների դեպքում: Քանի որ սպիտակ փտած սնկերի լակազները օքսիդազներ են, որոնք պարունակում են բազմաթիվ պղնձի ատոմներ, պղնձի իոնների ազդեցությունը լակազայի ակտիվության վրա բազմազան է և տատանվում է խթանիչից և արգելակիչից մինչև չեզոք։⁵¹ Ի տարբերություն դրա, Չժոու և այլք[52]հաղորդել է, որCu²⁺կասեցրել է Թայվանի ստորգետնյա տերմիտի (Odontotermes formosanus) լակկազի ակտիվությունը։ Սակայն, Cerena sp. HYB07-ի լակկազները[53]և Clitocybe maxima[54]չեն ազդվել պղնձի իոններից։
Սուբստրատի յուրահատկությունը ներկայացված էր դրա կինետիկ պարամետրերով (Km և Vmax). որքան ուժեղ է սուբստրատի կապման կապը ֆերմենտի հետ, այնքան ցածր է Km արժեքը և այնքան բարձր է սուբստրատի յուրահատկությունը։3,21,55*Pleurotus ostreatus* NRC 620-ից ստացված լակկազի կինետիկ պարամետրերը (Km և Vmax) որոշվել են GraphPad Prism 6.0 ծրագրի միջոցով՝ Lineweaver-Burk գրաֆիկը կառուցելով (Նկար 5): ABTS-ը որպես սուբստրատ օգտագործելիս արդյունքները կազմել են 1.99 մՄ և 16217 մկմոլ:րոպե⁻¹ Լ⁻¹,համապատասխանաբար։ Էլսայեդ և այլք։21Հաղորդվել է, որ ABTS օքսիդացման Km արժեքները համապատասխանաբար կազմել են 0.1 մՄ և 0.064 մՄ, ինչը վկայում է Lac A և Lac B իզոֆերմենտների բարձր կապակցության մասին ABTS-ի նկատմամբ: Ավելին, Vmax արժեքները կազմել են 0.182 մմոլ:րոպե⁻¹և 0.603 մկմոլրոպե⁻¹համապատասխանաբար։ Ստացված Km արժեքը ցածր էր, քան Trametes polyzona WRF03-ինը (8.66 մՄ)։ Ավելին, դրանց Vmax արժեքը (1429 մմոլ մին-1) նույնպեսցածրերբ ABTS-ը օգտագործվում է որպես սուբստրատ։33 Նմանապես, Lentinus squarrosulus MR13 և Trametes sp. AH28-2 լակկազի կոնցենտրացիաների Km արժեքները համապատասխանաբար կազմել են 0.0714 մՄ և 0.025 մՄ, իսկ Vmax արժեքները՝ 0.0091 մՄ րոպե−1 և 0.67 մՄ րոպե−1 մգ−1 (ABTS-ի համեմատ):համապատասխանաբար։56,57
Հետազոտվել է ABTS կոնցենտրացիայի ազդեցությունը *Pleurotus ostreatus* NRC 620-ից ստացված լակկազի ակտիվության վրա, և գծագրվել է սկզբնական ռեակցիայի արագության և ABTS կոնցենտրացիայի հակադարձի Lineweaver-Burk գրաֆիկը: Լակկազի տարբեր կոնցենտրացիաներով (0.025–3.0 մՄ) ABTS-ի օքսիդացման ռեակցիան չափվել է pH 4.5-ում՝ կինետիկ պարամետրերը (Vmax և Km) որոշելու համար: Միքայելիս-Մենտենի կինետիկ հաստատունները հաշվարկվել են ռեակցիայի արագության և սուբստրատի կոնցենտրացիայի հակադարձի Lineweaver-Burk գրաֆիկի միջոցով: Կինետիկ հաստատունները հաշվարկվել են Lineweaver-Burk գրաֆիկից՝ օգտագործելով GraphPad Prism 6.01 ծրագիրը:
Ավանդական պարզաբանող ֆերմենտները, ինչպիսիք են պեկտինազները, հիդրոլիզում են պեկտինային նյութերը՝ նվազեցնելով մածուցիկությունը և պղտորությունը: Դրանք արդյունավետորեն քայքայում են կառուցվածքային պոլիսախարիդները և հաճախ օգտագործվում են այլ ֆերմենտների, ինչպիսիք են ցելյուլազները և հեմիցելյուլազները, հետ համատեղ՝ բերքատվությունը և պարզությունը բարելավելու համար: Այնուամենայնիվ, պեկտինազները հատուկ չեն թիրախավորում ֆենոլային միացությունները, որոնք պղտորության և օքսիդատիվ շագանակագույնացման հիմնական պատճառներն են, մասնավորապես՝ խնձորի և խաղողի հյութերի նման հյութերում:58Ի տարբերություն դրա, լակազները կատալիզացնում են ֆենոլային միացությունների օքսիդացումը՝ դրանք պոլիմերացնելով ավելի մեծ, անլուծելի մոլեկուլների, որոնք կարող են հեռացվել նստվածքի կամ ֆիլտրացիայի միջոցով: Այս մեխանիզմը ոչ միայն բարելավում է հյութի թափանցիկությունը, այլև երկարացնում է հյութի պահպանման ժամկետը՝ նվազեցնելով ֆենոլային միացությունների պատճառով առաջացող օքսիդատիվ շագանակագույնացման հավանականությունը: Ավելին, լակազի վրա հիմնված մաքրման գործընթացները կարող են իրականացվել մեղմ մշակման պայմաններում (pH 3.5–5.5, ջերմաստիճան 25–40 °C), ինչը դրանք դարձնում է նուրբ հյութերի համար հարմար՝ առանց վնասելու դրանց սննդային կամ օրգանոլեպտիկ հատկությունները:59Ուսումնասիրությունները ցույց են տվել, որ պեկտինազային մշակումը կարող է հյութը մաքրել 1-2 ժամվա ընթացքում, մինչդեռ լակկազի մշակումը սովորաբար պահանջում է ավելի երկար ռեակցիայի ժամանակ (3-6 ժամ)՝ ֆենոլային միացությունները լիովին վերականգնելու համար: Այնուամենայնիվ, այս գործընթացը կարելի է օպտիմալացնել՝ ֆերմենտը անշարժացնելով կամ լակազը մեխանիկական մաքրման մեթոդների հետ համատեղելով:60Այս ուսումնասիրության մեջ, հում քաղվածքի ֆերմենտային պրոֆիլավորումը ցույց տվեց լակկազի և α-ամիլազի նշանակալի ակտիվություն, մինչդեռ պեկտինազի և քսիլանազի ակտիվությունը չափազանց ցածր էր, և ցելյուլազի ակտիվություն չի հայտնաբերվել: Հետևաբար, պղտորության և ֆենոլային պարունակության նվազումը հիմնականում պայմանավորված էր լակկազի ազդեցությամբ, մինչդեռ մածուցիկության փոփոխությունը կարող էր մասամբ պայմանավորված լինել ամիլազի ազդեցությամբ:
Աղյուսակ 1-ում ներկայացված են թարմ քամած խնձորի հյութի և լակկազայով մշակված նմուշների ֆիզիկաքիմիական պարամետրերը: Արդյունքները ցույց են տվել, որ թարմ քամած խնձորի հյութի ելքը (71.59%) ավելի ցածր էր, քան լակկազայով մշակված նմուշներինը (87.34%): Այս արդյունքները համապատասխանում են Պիլնիկի և Օրանժի արդյունքներին:61, ովքեր նշել են, որ մրգերի վերամշակման մեջ ֆերմենտների օգտագործումը կարող է մեծացնել հյութի արտադրությունը, բարելավել ֆիլտրացիան և ստանալ բարձրորակ, թափանցիկ հյութ՝ խտացման համար: Հյութի արտադրության աճը հիմնականում պայմանավորված է հյութում լուծվող շաքարների պարունակության աճով: Մրգերի ֆերմենտատիվ հիդրոլիզի ընթացքում արտադրանքի բջջային պատերում գտնվող մեզոգլեան և պեկտինը քայքայվում են և վերածվում լուծվող նյութերի, ինչպիսիք են չեզոք շաքարները և թթուները:62։Ֆերմենտային մշակմամբ մշակված խնձորի հյութի pH արժեքը զգալիորեն ցածր էր վերահսկիչ խմբի համեմատ (P < 0.05), և երկու խմբերի pH արժեքը զգալիորեն բարձրացել է պահպանման ընթացքում (տե՛ս աղյուսակ 1): Այս արդյունքները համապատասխանում են Մարկի և այլոց արդյունքներին:63, ովքեր նշել են, որ ջերմային մշակումից հետո պահպանումից հետո կեշյուի հյութի pH-ը նվազել է: Պեկտինի քայքայումը և գալակտուրոնաթթվի առաջացումը ֆերմենտային մշակումից հետո կարող են պատասխանատու լինել պահպանման ընթացքում pH-ի բարձրացման համար: Ֆերմենտային մշակմամբ մշակված նմուշների pH-ը պահպանման ողջ ընթացքում մնացել է 4.05-ից 4.31 միջակայքում, մինչդեռ չմշակված խնձորի հյութի pH-ը տատանվել է 4.12-ից 4.33 միջակայքում:
Թե՛ չմշակված, թե՛ լակկազայով մշակված նմուշների ընդհանուր թթվայնությունը (ԸԹ) պահպանման ժամանակի աճին զուգընթաց նվազման միտում է ցուցաբերել (տե՛ս աղյուսակ 1): Թթվայնության նվազումը պայմանավորված է օրգանական թթուների ածխաջրերի փոխակերպմամբ կամ ֆերմենտատիվ ռեակցիաներով, ինչպես նաև հյութի պահպանման ընթացքում օքսիդացմամբ:64Վերահսկիչ խնձորի հյութի և ֆերմենտներով մշակված նմուշների ընդհանուր թթվայնությունը ցածր էր մյուս հյութերի համեմատ (ելակի հյութ՝ 0.9%, սալորի հյութ՝ 2.2%, կումկվատի հյութ՝ 1.0%, ծիրանի հյութ՝ 2.4%, նարնջի հյութ՝ 0.8%), սակայն նման էր մյուս հյութերի թթվայնությանը (օրինակ՝ տանձի հյութ՝ 0.3%):62Չմշակված թարմ քամած խնձորի հյութի այս տարբերությունները կարող են պայմանավորված լինել տարբեր գործոններով, ինչպիսիք են աճեցման պայմանները, գենետիկական գործոնները, հասունության մակարդակը և մշակման մեթոդները:65Վերահսկիչ և լակկազայով մշակված խնձորի հյութի ընդհանուր թթվայնության նվազումը համապատասխանում է Սինգհի և այլոց կողմից ներկայացված արդյունքներին։66Ջին Նուո խնձորի հյութի ընդհանուր թթվայնության նվազման վերաբերյալ 74 օրվա պահպանումից հետո։ Մյուս կողմից, Օշմիանսկին և Վոյդիլոն67Ավանդական մաքրման մեթոդների ազդեցությունն ուսումնասիրելիս խնձորի հյութի թթվայնության որևէ էական փոփոխություն չի հայտնաբերվել։
Աղյուսակ 1-ում ներկայացված արդյունքները ցույց են տալիս, որ լակկազայով մշակված խնձորի հյութի ընդհանուր լուծվող պինդ նյութերի (TSS) արժեքը ավելի բարձր էր, քան չմշակված նմուշինը։ Այս արդյունքները համապատասխանում են հրապարակված ուսումնասիրություններին։. 68Ավելին, աղյուսակ 1-ը ցույց է տալիս, որ վերահսկիչ խնձորի հյութի խմբի TSS արժեքը սկզբնական պահին կազմել է 9.58 և պահպանման ժամկետի ավարտին հասել է 11.05-ի։ Այս արժեքները ցածր են Համիդի և այլոց կողմից հաղորդված թարմ խնձորի հյութի TSS արժեքներից։. 69(համապատասխանաբար՝ 11.2 և 11.80): Լակկազայով մշակված խնձորի հյութի նմուշների TSS արժեքը զգալիորեն աճել է՝ սկսած 11.23-ից և հասնելով 12.93-ի՝ 4°C ջերմաստիճանում երկու շաբաթ պահելուց հետո (տե՛ս աղյուսակ 1): TSS-ի նմանատիպ աճ պահպանման ընթացքում նկատվել է նաև ցիտրուսային մրգերի, կիտրոնների և քաղցր նարինջների մոտ: Պահպանման ընթացքում ընդհանուր լուծվող պինդ նյութերի (TSS) աճը կարող է պայմանավորված լինել պոլիսախարիդների (օսլա) մոնոսախարիդների (շաքարների) հիդրոլիզով, հյութի ջրազրկման պատճառով կոնցենտրացիայի աճով և հյութում պեկտինի քայքայմամբ՝ լուծվող պինդ նյութերի: Ընդհանուր լուծվող պինդ նյութերի (TSS) աճը, հավանաբար, պայմանավորված է լուծվող շաքարների աճով, որոնք կարող են առաջանալ պեկտինի կամ ցելյուլոզի լուծվող շաքարների փոխակերպման միջոցով՝ համապատասխանաբար պեկտինի կամ ցելյուլոզի միջոցով, կամ օսլայի հիդրոլիզով շաքարների, ինչպես նշել են Համեդը և այլք:69.Լակկազի ազդեցությունը խնձորի հյութի հատկությունների վրա կարելի է դիտարկել տեսողականորեն, քանի որ լակկազայով մշակված խնձորի հյութը ցուցաբերում է ավելի լավ հոսունություն և ավելի ցածր մածուցիկություն, քան չմշակված հյութը։ Այս դիտարկումը գրանցված է աղյուսակ 1-ում. Ֆերմենտով մշակված նմուշի մածուցիկությունը կազմել է 1.87 cP, մինչդեռ վերահսկիչ նմուշի մածուցիկությունը՝ 2.95 cP։ Մածուցիկության այս զգալի նվազումը, հավանաբար, պայմանավորված է պեկտինանման նյութերի ավելի բարձր ջուր պահելու ունակությամբ և կպչուն ցանցային կառուցվածքի ձևավորմամբ։
Այս ուսումնասիրության մեջ լակկազի ազդեցությունը խնձորի հյութի շագանակագույնացման ինդեքսի (BI) վրա ուսումնասիրվել է՝ սպեկտրոֆոտոմետրի միջոցով 420 նմ-ում կլանումը չափելով։ Արդյունքները ներկայացված են աղյուսակ 1-ում։ Պահպանման ընթացքում խնձորի հյութի նմուշների BI-ն և՛ մշակված, և՛ չմշակված խմբերում ցույց է տվել աստիճանական աճի միտում։ BI-ն արտացոլում է շագանակագույնացման աստիճանը և կարող է ծառայել որպեսկարևորֆերմենտատիվ և ոչ ֆերմենտային շագանակագույնացման ռեակցիաների ցուցիչ: Պահպանման ընթացքում կլանումը զգալիորեն աճել է (P < 0.05): Պահպանման ավարտին,A420Վերահսկիչ և ֆերմենտներով մշակված խմբերում խնձորի հյութի նմուշների արժեքը համապատասխանաբար աճել է մոտ 217%-ով և 121%-ով (տե՛ս աղյուսակ 1): Արդյունքները ցույց են տալիս, որ ֆերմենտային մշակումը կարող է արդյունավետորեն նվազեցնել շագանակագույնացման աստիճանը մոտ 56%-ով: Բեզերայի և այլոց արդյունքները...[19]] համապատասխանում են մեր արդյունքներին։ Նրանք օգտագործել են լակկազա-գլուտարալդեհիդ-կոկոսի մանրաթել՝ խնձորի հյութը մաքրելու համար, որի արդյունքում դրա սկզբնական գույնը նվազել է 61%-ով։
Չնայած մրգային հյութերի մեջ պարունակվող պոլիֆենոլները դրական սննդային և թերապևտիկ ազդեցություն ունեն մարդու օրգանիզմի վրա, դրանք կարող են նաև ռեակցիայի մեջ մտնել սպիտակուցների հետ՝ առաջացնելով հյութի մշուշոտություն, նստվածքագոյացում կամ պղտորություն, այդպիսով փոխելով արտադրանքի համն ու բույրը և կրճատելով դրա պահպանման ժամկետը։71Այս ուսումնասիրության նպատակն էր անվտանգ կերպով նվազեցնել խնձորի հյութի ֆենոլային միացությունների պարունակությունը՝ օգտագործելով Pleurotus ostreatus NRC 620-ի լակկասը: Աղյուսակ 1-ում ներկայացված արդյունքները ցույց են տալիս, որ լակկազայով մշակված խնձորի հյութի ֆենոլային միացությունների ընդհանուր պարունակությունը զգալիորեն նվազել է 4°C ջերմաստիճանում պահելուց առաջ: Ավելին, ուսումնասիրված երկու նմուշներում էլ ֆենոլային միացությունների ընդհանուր պարունակությունը նվազել է նաև պահպանման ընթացքում (աղյուսակ 1): Սանդրիի և այլոց հետազոտությունը:72ցույց տվեցին, որ ֆերմենտներով մշակված խնձորի հյութը կարող է պահպանել իր հակաօքսիդանտային ակտիվությունը և ֆենոլային միացությունների պարունակությունը: Այնուամենայնիվ, Լեթերայի և այլոց ուսումնասիրության արդյունքները...73ցույց են տալիս, որ նարնջի հյութի մշակումը սնկային լակկասայով կարող է նվազեցնել դրա մեջ ֆենոլային միացությունների պարունակությունը մինչև 45%-ով։
Ապացուցված է, որ ֆենոլային միացություններն ունեն այնպիսի հատկություններ, ինչպիսիք են ազատ ռադիկալների կլանումը, սինգլետային թթվածնի վերականգնումը և մարումը, ջրածնի ատոմի փոխանցումը և ազատ ռադիկալներին էլեկտրոնների նվիրաբերումը, ինչը դրանք դարձնում է հզոր հակաօքսիդանտներ։74Հետևաբար, այս ուսումնասիրության մեջ DPPH և FRAP-ի վրա հիմնված մեթոդները օգտագործվել են լակկազի ազդեցությունը սառնարանում 14 օր պահված խնձորի հյութի հակաօքսիդանտային ակտիվության վրա գնահատելու համար (տե՛ս աղյուսակ 2): Երկու մեթոդներն էլ ցույց են տվել հակաօքսիդանտային ակտիվության աճ պահպանման ընթացքում, որը կարող է պայմանավորված լինել ազատ ֆենոլային միացությունների ավելացմամբ կամ Մայալարդի ռեակցիայի արգասիքների (MRP) առաջացմամբ, ընդ որում՝ Մայալարդի ռեակցիայի արգասիքները, հավանաբար, հակաօքսիդանտային ակտիվության աճի պատճառն են:75Ոչ ֆերմենտային շագանակագույնացման ռեակցիաները (ներառյալ ասկորբինաթթվի քայքայումը, Մայալարի ռեակցիաները և շաքարների թթվային կատալիզացված քայքայումը) առաջացնում են շագանակագույն գունանյութեր (մելանոիդիններ): Ասկորբինաթթվի միջանկյալ քայքայման արգասիքները և շաքարի քայքայման արգասիքները (օրինակ՝ կարբոնիլային միացությունները) կարող են ռեակցիայի մեջ մտնել ամինաթթուների հետ Մայալարի ռեակցիաների միջոցով:76Չնայած մրգերի և բանջարեղենի դարչնագույնացումը պահպանման ընթացքում լայնորեն ուսումնասիրվել է, այս ռեակցիաների վերաբերյալ մեր պատկերացումները մնում են սահմանափակ։77FRAP մեթոդի համեմատ, լակկազայով մշակված խնձորի հյութը DPPH մեթոդով ցույց է տվել զգալիորեն ցածր հակաօքսիդանտային ակտիվություն (տե՛ս աղյուսակ 2), և բոլոր նմուշների հակաօքսիդանտային ակտիվությունը զգալիորեն աճել է պահպանման ժամանակի ավելացմանը զուգընթաց: Այս ուսումնասիրության մեջ օգտագործվել են հակաօքսիդանտային ակտիվությունը որոշելու երկու տարբեր մեթոդներ, քանի որ դրանց սկզբունքները տարբերվում են: DPPH մեթոդը չափում է ազատ ռադիկալները չեզոքացնելու ունակությունը, մինչդեռ FRAP մեթոդը՝ երկաթի իոնները նվազեցնելու ունակությունը: Հետևաբար, ուսումնասիրված նմուշների հակաօքսիդանտային ակտիվությունն ավելի լավ հասկանալու համար խորհուրդ է տրվում օգտագործել հակաօքսիդանտային ակտիվությունը որոշելու մի քանի մեթոդներ:78
Այս ուսումնասիրության հիմնական արդյունքներից մեկն այն է, որ *Pleurotus ostreatus* լակկասը NRC 620 ցուցաբերում է օպտիմալ ակտիվություն 70°C ջերմաստիճանում և pH 3.0-ում: Հյութերի մաքրման համար սովորաբար օգտագործվող այլ սնկային լակկասների, ինչպիսիք են *Trametes versicolor* և *Ganoderma lucidum* լակկասները, համեմատած *P. ostreatus* NRC 620-ը ցուցաբերում է ավելի բարձր ջերմային կայունություն և ավելի թթվային pH: *Trametes versicolor* և *Ganoderma lucidum*-ի լակկասները սովորաբար ցուցաբերում են օպտիմալ ակտիվություն 50-60°C սահմաններում և pH 3.5-ից 5.0-ի միջև: Այս տարբերությունը կարող է նպաստել հյութի մաքրման արդյունավետության բարելավմանը, հատկապես թթվային հյութերի համար, որտեղ ցածր pH արժեքների դեպքում կայունությունը կարևոր է: *P.-ի եզակի բնութագիրը՝ համեմատած այլ ուսումնասիրված սնկային լակկասների հետ, *Pleurotus ostreatus* NRC 620-ը ցուցաբերում է ավելի դժվար պայմաններում արդյունավետ գործելու ունակություն: Դրա ավելի բարձր օպտիմալ ակտիվության ջերմաստիճանը ենթադրում է արդյունաբերական կիրառություններում պոտենցիալ առավելություններ, ինչպիսիք են ավելի արագ ռեակցիայի արագությունը և մանրէային աղտոտվածության նվազեցումը: Դրա ցածր pH-ը, որը լավ համապատասխանում է շատ հյութերի թթվային բնույթին, կարող է օգտակար լինել հյութի մաքրման գործընթացներում: Այս արդյունքները հիմք են հանդիսանում լայնածավալ կիրառման հետագա ուսումնասիրության համար, ինչը *Pleurotus ostreatus* NRC 620-ը դարձնում է կենսունակ այլընտրանք սնկային լակկազի ավանդական աղբյուրներին: Նախորդ ուսումնասիրությունների համեմատ մենք պարզեցինք, որ օպտիմալ ջերմաստիճանը 60°C է, իսկ օպտիմալ pH-ը՝ 3.0: 60°C-ում 80 րոպե ռեակցիայից հետո *Ganoderma lucidum* լակկազան պահպանվել է:46իր գործունեության %-ը։79 Ըստ Կուրնյավատիի և Նիցելի80*Ganoderma lucidum* ֆերմենտները ցուցաբերում են գերազանցից մինչև միջին կայունություն 25°C ջերմաստիճանում և pH-ի 5.0-ից մինչև 8.0 արժեքներում, ինչպես նաև կայունություն pH 6.0-ում և 10-ից մինչև 30°C ջերմաստիճաններում: Այս ուսումնասիրության մեջ մենք պարզեցինք, որ *Pleurotus ostreatus*-ի համար ֆերմենտային ակտիվության օպտիմալ pH-ը և ջերմաստիճանը համապատասխանաբար 3.0 և 70°C էին: Երկու ժամ 40°C և 50°C ջերմաստիճաններում ինկուբացիայից հետո ֆերմենտը պահպանել է իր ակտիվության համապատասխանաբար 68.33%-ը և 59.61%-ը: Ավելին, Pleurotus ostreatus NRC 620 լակկասը ցուցաբերել է բարձր ակտիվություն 50°C-ից մինչև 80°C լայն ջերմաստիճանային միջակայքում՝ գրեթե հասնելով առավելագույն ակտիվության (69%–98%), առավելագույն ակտիվությունը դիտվել է 70°C ջերմաստիճանում:
Ամփոփելով՝ ստատիկ պայմաններում ստացված խեցգետնի սնկի լակկասը NRC620 ցուցաբերել է օպտիմալ ակտիվություն և կայունություն pH-ի և ջերմաստիճանի տարբեր պայմաններում՝ ցուցաբերելով գերազանց կայունություն այլ ֆերմենտային աղբյուրների համեմատ: 10 մՄ MgSO₄-ի և CuSO₄-ի ավելացումը մեծացրել է ֆերմենտային ակտիվությունը համապատասխանաբար մոտավորապես 21%-ով և 35%-ով: Խնձորի հյութի մեջ վերամշակելիս ֆերմենտը նվազեցրել է pH-ը և մածուցիկությունը, մինչդեռ ֆենոլային պարունակությունը պահպանման ընթացքում նվազել է միայն աննշան չափով:
Արդյունքները հաստատում են լակկազի ներուժը սննդի արդյունաբերության մեջ, մասնավորապես՝ ըմպելիքների մաքրման գործում: Ֆենոլային միացությունները հատուկ քայքայելով՝ լակկասը ոչ միայն նվազեցնում է պղտորությունը և բարելավում մաքրությունը, այլև պահպանում է մրգային հյութերի որակը մեղմ աշխատանքային պայմաններում: Ի տարբերություն ավանդական մաքրող նյութերի, ինչպիսիք են ժելատինը, բենտոնիտը և սիլիցիումային գելը, լակկասը չի առաջացնում թափոններ և չի հեռացնում հաճելի բույրերը ըմպելիքներից, ինչը այն դարձնում է ավելի էկոլոգիապես մաքուր և կայուն տարբերակ: Ավելին, համեմատած այլ ֆերմենտների և ֆիլտրման մեթոդների հետ, լակկասը առաջարկում է նպատակային և ծախսարդյունավետ լուծում՝ առանց ապրանքի որակի վրա ազդելու:
Կյոմուհիմբո, ՀԴ և Բրինկ, ՀԳ։ Պղինձ պարունակող լակազների կիրառությունները և անշարժացման ռազմավարությունները. ակնարկ։ Heliyon 9, e13156 (2023)։
Հրապարակման ժամանակը. Դեկտեմբերի 15-2025